二级蒸馏对竹醋液抑菌与抗氧化效果的影响

摘要:比较了一级蒸馏和二级蒸馏竹醋液的抑菌效果以及其自由基清除能力、总酚和总黄酮的含量，并通过高效液相色谱对相关活性组分含量进行分析。结果表明: 一级蒸馏和二级蒸馏竹醋液对大肠杆菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠酵母、黑曲霉均表现出较好的抑制效果和较强的抗氧化能力，但二级蒸馏会显著降低竹醋液的抑菌能力及抗氧化能力。此外，高效液相色谱检测结果表明，二级蒸馏后竹醋液在 254 nm 和 270 nm 波长下吸收峰的数量和峰面积均显著降低。竹醋是竹炭生产的副产物，即竹材经炭化、热解产生的具特殊焦烟气味的黄色或红褐色液体。竹醋具有去异味、杀菌、除虫、抗病毒、促进植物生长、防止血糖降低等作用，因此作为一种绿色、天然、环保的新资源，竹醋在农业、医疗、化工食品等领域具有良好的应用前景。研究表明，竹醋可以延缓草鱼肉块腐败变质，延长其货架期。竹醋与壳聚糖复配用于圣女果保鲜，既可延长保藏时间，又不损害果实的外观及品质。竹醋的超氧阴离子、二苯代苦味酰基自由基( DPPH·) 清除能力与茶多酚相近，但竹醋液具有的特殊焦烟气味可能会影响食品的风味，从而限制其在食品保鲜中的应用。因此，需要对竹醋液通过二级蒸馏进行精制，精制后的竹醋液较原液更加透明，烟熏酸味变淡。然而，二级蒸馏后对竹醋液的抑菌能力、抗氧化能力及功效组成成分含量的影响还鲜有报道。因此，本研究考察并比较了竹醋一级蒸馏和二级蒸馏液的抑菌性能、抗氧化性及代谢指纹图谱，以期为将精制竹醋液开发成抑菌、杀菌、防腐剂等产品提供一定的理论依据。

1 材料与方法
1. 1 实验材料
1. 1. 1 样品
竹醋液由江阴中炬生物科技有限公司提供，制作纯化采用江阴中炬生物科技有限公司 2010－1 型竹木醋提取提纯设备。竹醋液制备工艺为竹材破碎后制成竹片，然后将其干馏和炭化，进行两级冷凝，并将两级冷凝所得的竹醋液在混合罐中混合后静置。将 pH 值为2. 5 ～3. 0 的竹醋液置于 40 ～100 ℃、真空度 0. 080 MPa 以上的条件下进行一级蒸馏，至馏出体积为原液体积的 80% ～90% 时即可，所得到的馏出液，进行冷凝归集。将一级蒸馏液置于40 ～100 ℃ 、真空度 0. 085 MPa 以上的条件下进行二级蒸馏，至馏出体积为原有体积的 80% ～90% 时即为二级蒸馏液。
1. 1. 2 试剂
三吡啶三吖嗪( TPTZ) 、2，2'-联氮－双-( 3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸) ( ABTS) 、二苯代苦味酰基( DP-PH) 等均购于 Sigma-Aldrich 公司。色谱纯的甲醇和乙酸购自 Fisher 公司，其他试剂均为分析纯。
1. 1. 3 菌株
大肠杆菌 ( Escherichia coli) 、铜绿假单胞菌( Pseudomonas aeruginosa) 、金黄色葡萄球菌( Staphy-lococcus aureus) 、白色念珠酵母 ( Canidia albicans) 、黑曲霉( Aspergillus niger) 均为本实验室保存。
1. 1. 4 培养基
PDA 培养基: 马铃薯 200 g，葡萄糖 20 g，琼脂 18g，加水补足 1 L，121 ℃ 灭菌 15 min。 LB 培养基: 胰蛋白胨10 g，酵母膏5 g，NaCl 10 g，琼脂18 g，加水补足1 L，用 NaOH 调 pH 值至7. 0 ～7. 2，121 ℃灭菌15min。 YPD 培养基: 酵母浸粉 10 g，蛋白胨 20 g，葡萄糖 20 g，琼脂18 g，加水补足 1 L，121 ℃灭菌15 min。
1. 2 实验仪器
DH 500 AB 型电热恒温培养箱，天津市泰斯特仪器有限公司; SHH－50L 型生化培养箱，重庆四达实验仪器有限公司; MJX－250Ⅱ型霉菌培养箱，广州省医疗器械厂; T6 型新世纪紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限公司; QL－901 型振荡器，海门市其林贝尔仪器制造有限公司; CL200+型笔式余氯/pH/OＲP 计，上海三信仪表厂; ES －300A 型电子天平，长沙湘平科技发展有限公司，1100 型高效液相色谱仪( high performance liquid chromatography，HPLC) ，安捷伦公司; UV2450 型分光光度计，Shi-madzu 公司。
1. 3 测定方法
1. 3. 1 滤纸片扩散法测定抑菌作用
取竹醋液于超净工作台中用无菌水配成体积分数为 70%，50%，30%，20%，10% 的稀释液。取 50μL 菌悬液( 细菌浓度为 1 × 106个/mL，真菌为 1 ×105个/mL) 铺板，将滤纸片放至平板中央，加 30 μL样品，以水作对照。适温培养( 细菌 37 ℃培养，霉菌25 ℃ 培养，酵母 28 ℃ 培养) ，待对照长满后，测量抑菌圈直径。
1. 3. 2 比浊法测定杀菌作用
每支试管加入2. 5 mL 配置好的样品－培养基混合物，然后再加入 0. 5 mL 菌悬液，菌悬液浓度分别为: 细菌1 ×107个/mL; 白色念珠酵母1 ×107个/mL; 黑曲霉 600 nm 下的透光度 T =75% ( ±2%) 。充分震荡后，摇床培养，细菌 37 ℃、150 r/min，黑曲霉的培养条件为 25 ℃、150 r/min，酵母的培养条件为 28℃ 、150 r / min。培养 24 h。取 50 μL 菌液涂板。 E。 co-li、S。 aureus 于 37 ℃ 培养，A。 niger 于 25 ℃ 中培养，酵母于 28 ℃培养。待对照长满板后，观察结果。
1. 3. 3 抗氧化指标的测定
测量体系含 0. 2 mL 样品，3 mL TPTZ 工作液和0. 3 mL 醋酸盐缓冲液( 0. 3 mol / L，pH = 3. 6) ，37 ℃下放置45 min 后于593 nm 下测其吸光度，样品总自由基清除能力以每毫升样品中含有的活性单位来表示( U/mL) 。
清除 DPPH 自由基能力的测定，将对 DPPH 自由基 50% 清除率定义为 1 个活性单位( U) ，清除 DPPH 自由基能力以每克鲜重样品中含有的活性单位来表示( U·( g·fw)－ 1) 。羟自由基清除能力的测定依据刘骏的方法。
将对羟自由基 50% 清除率定义为 1 个活性单位( U) ，清除羟自由基清除能力以每毫升样品中含有的活性单位来表示( U/mL) 。
0. 2 mL 样品，1. 0 mL 磷酸缓冲液( PBS) ( 0. 2 mol/L，pH 值为6. 6) 和 1. 0 mL 1% 铁氰化钾混合均匀，于 50 ℃ 水浴锅中放置 20 min，取出后立即冷却，体系降温后加入1. 0 mL 10% 三氯乙酸 ( TCA) ，充分混匀后取出 1mL，再加入 2 mL 蒸馏水和 0. 3 mL 0. 1% FeCl3，放置10 min 后于 700 nm 下测其吸光度。超氧阴离子能力的测定采用氮蓝四唑光照法。将对超氧阴离子 50% 清除率定义为 1 个活性单位( U) ，清除超氧阴离子自由基清除能力以每毫升样品中含有的活性单位来表示( U/mL) 。
1. 3. 4 总酚和总黄酮的测定
以没食子酸作标准曲线，样品的总酚含量换算为每毫升样品中没食子酸的含量( μg/mL) 。
以芦丁作标准曲线，样品中总黄酮含量换算为每毫升样品中芦丁的含量( μg/mL) 。
1. 3. 5 竹醋的 HPLC 指纹图谱分析
竹醋样品采用 HPLC，选用 254，270 nm 波长进行分析。色谱条件: ODS-3 ( 250 mm × 4. 6 mm，5μm) 色谱柱; 流动相为 1% 乙酸水溶液( B) －甲醇( C) ; 梯度洗脱为流速 1 mL/min; 进样量 10 μL;二极管阵列检测器( DAD) ，设定波长 254 nm 和 270nm 。

2 结果与分析
2. 1 二级蒸馏对竹醋液抑菌效果的影响
竹醋一级蒸馏液和二级蒸馏液的抑菌效果的比较。竹醋液对 E。 coli、P。 aeruginosa、S。 aureus、C。 albicans、A。 niger 均表现出不同程度的抑制作用，且其中一级蒸馏液的抑菌效果均优于二级蒸馏液。与一级蒸馏液相比，二级蒸馏液对 E。 coli、P。 aeruginosa、S。 aureus、C。 albicans、A。niger 的抑菌圈直径分别减小了 31. 48% ，15. 38% ，34. 78% ，47. 62% ，50. 85% ，表明将竹醋液二级蒸馏可降低其抑菌效果。
2. 2 二级蒸馏对竹醋液杀菌效果的影响
比较了竹醋一级蒸馏液和二级蒸馏液对 5种指示菌的致死浓度。结果表明，两种竹醋液对液体培养的 E。 coli、P。 aeruginosa、S。 aureus、C。 albicans、A。 niger 均表现出较强的抑制作用，浓度为 25% 及以上的竹醋一级蒸馏液和二级蒸馏液可完全抑制 5 种受试菌的生长。此外，由竹醋一级蒸馏液和二级蒸馏液再铺板结果可知，两种竹醋液对 E。 coli 及 C。 al-bicans 的最低杀菌浓度均为 5% 。而竹醋一级蒸馏液对 P。 aeruginosa、S。 aureas 及 A。 niger 的最低杀菌浓度均低于二级蒸馏液。可以看出二次蒸馏处理促进竹醋的最低杀菌浓度升高。
2. 3 二级蒸馏对竹醋液抗氧化能力的影响
对竹醋一级蒸馏液和二级蒸馏液抗氧化能力进行了比较。结果表明，与一级蒸馏液相比，竹醋二级蒸馏液的 DPPH 自由基清除能力、总抗氧化能力、超氧阴离子清除能力、总还原能力分别下降了64. 48% ，94. 66% ，59. 92% ，90. 46% 。而竹醋一级蒸馏液和二级蒸馏液的羟自由基清除能力并无明显差异。
2. 4 二级蒸馏对竹醋液总酚、总黄酮含量的影响
对竹醋一级蒸馏液和二级蒸馏液中总酚，总黄酮含量进行了比较。结果表明，竹醋一级蒸馏液中的总酚、总黄酮质量浓度分别为 60. 23 μg/mL和 93. 59 μg/mL，而二级蒸馏液中的总酚、总黄酮质量浓度仅为 21. 91 μg/mL 和 4. 41 μg/mL，分别减少了 63. 62%和 95. 29%。
2. 5 二级蒸馏对竹醋液功效成分的影响
取竹醋一级蒸馏液和二级蒸馏液样品分别进行HPLC 指纹图谱分析，测定两种样品在 254 nm 和270 nm 波长下的吸收峰。结果表明，竹醋一级蒸馏液样品在 254 nm 波长下通过分析获得22 个吸收峰，在 270 nm 波长下得到 27 个吸收峰。
而竹醋二级蒸馏液样品在 254 nm 下仅获得 1#、4#、7#、9#和 13#5 个吸收峰，这 5 个峰峰面积分别为875. 7，393. 8，64. 0，46. 7，34. 0 mAU·s，均显著低于一级蒸馏液吸收峰面积。此外竹醋二级蒸馏液样品在 270 nm 下仅获得 1#、6#、11#、12#和 15#5 个吸收峰，峰面积分别为 182. 1，1 048. 7，130. 9，26. 7，77. 4 mAU·s，与竹醋一级蒸馏液相比，二级蒸馏液峰面积值分别降低了 63. 52% ，29. 79% ，75. 61% ，92. 74% ，86. 46% 。以上结果表明，二级蒸馏过程将造成竹醋液中酚类及黄酮类等功效活性成分的损失。

来源：惠合胶体磨研磨设备厂

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