肝素修饰尿激酶的制备方法

摘要：本文介绍了一种用肝素对尿激酶进行化学修饰的方法，以改善其稳定性。经肝素修饰的尿激酶对蛋白酶有较强的抗水解能力，对热及 pH 亦具有较强的稳定性。肝素修饰尿激酶比活为 1.25×105u/mg，分子量为 58kDa。该修饰法获得的尿激酶半衰期明显延长，可大大提高其临床疗效。
尿激酶（urokinase，简称 UK）是一种能使纤维蛋白原活化并生成具有溶解性纤维蛋白能力的纤维蛋白溶解酶，属丝氨酸蛋白酶类，等电点在 8.4-9.7之间。适用于各种血栓病及心肌梗死等疾病的临床治疗。此外，尿激酶还参与体内许多重要的生物学过程，如排卵、细胞生长与分化、癌变及炎症发生等。
由于尿激酶主要提取自人尿或肾细胞的组织培养液，因此尿激酶和其他纤维蛋白溶解酶相比具有无抗原性、无热源、毒副作用小、特异性高和疗效确切等多个优点。但其在人体内的半衰期只有15min，活性不稳定。因此，在体外将尿激酶侧链基团通过人工方法与一些化学基团，特别是具有生理相容性的大分子基团以共价键连接，从而增强尿激酶构象的稳定性、耐热性、耐酸碱性和抗蛋白酶水解能力，加强其临床疗效是非常必要的。
本文介绍了一种肝素修饰尿激酶的制备方法，并对其耐热、耐酸碱、抗蛋白酶水解能力等性能进行了研究，以期为其应用提供参考。

1 材料
1.1 仪器
电子天平 DV215CD；真空冷冻干燥机 LGJ-10；冷冻离心机 Allegra X-15R。
1.2 试剂
尿激酶冻干粉，购自天津应用科学研究所；肝素，购自北京桑普生化试剂公司；蛋白质 Marker，购自 Sigma 公司；高碘酸钠、亚硫酸氢钠、三羟甲基氨基甲烷（生化试剂）、磷酸氢二钠及磷酸二氢钠均为分析纯。

2 方法
2.1 尿激酶的肝素修饰
低分子肝素的活化：称取肝素 1.0g 溶于 10mL蒸馏水中，加 12%的高碘酸钠溶液 1mL，调 pH 5.0，4℃下搅拌反应 20h，滴加 10%的亚硫酸氢钠溶液至变色，得活化的低分子肝素溶液。
尿激酶的化学修饰反应：称取尿激酶 0.5g，溶于0.3mol/L、pH 7.8 的磷酸盐缓冲液 15mL 中，加活化的低分子肝素溶液 10mL，4℃下电磁搅拌反应 24h。反应后经葡聚糖凝胶 G-100 柱分离，收集活性洗脱液，冷冻干燥，得粉末状低分子肝素-尿激酶结合物。
2.2 肝素修饰尿激酶对蛋白酶水解、热及 pH 稳定性分析
2.2.1 抗蛋白酶水解能力
将同一浓度修饰尿激酶和未修饰尿激酶分别加人 l5％胃蛋白酶溶液中。pH 7.8 保温 37℃，于 0h，2h，4h，6h 分别取样，测定其活性。
2.2.2 耐热稳定性试验
将修饰尿激酶和未修饰尿激酶分别置于 30℃，40℃，50℃，60℃，70℃ 的恒温水浴箱中，pH 7.8 保温 30min 后测定其活性。
2.2.3 耐酸碱性试验
将修饰尿激酶和未修饰尿激酶分别溶于 PH2.0，4.0，6.0，8.0，10.0 的磷酸盐缓冲液中，于 37℃恒温 30min 后检测其活性。
2.3 尿激酶活性测定
酶活力测定方法参照文献。

3 结果与分析
3.1 修饰和未修饰初始酶的活力
经高碘酸钠活化的肝素除 1→3 连接的糖苷键外其他类型的糖苷键均被高碘酸钠氧化与水生成不同的醛，从而与尿激酶分子中的 ε-氨基进行不同程度的修饰。采用肝素修饰的尿激酶，其活力明显高于未修饰尿激酶，因此采用低分子量肝素对尿激酶进行修饰是可行的。
3.2 抗蛋白酶水解能力
采用肝素修饰后的尿激酶，其抗蛋白酶水解能力明显增强。蛋白水解酶作用于酶分子某些特定敏感键后，导致蛋白质多肽键断裂，交联于尿激酶上的肝素能产生空间障碍，阻挡蛋白水解酶接近尿激酶，能“遮盖”尿激酶分子敏感键免遭破坏。此外尿激酶分子上许多敏感基团，如赖氨酸的ε-氨基等参与修饰反应，交联上肝素分子后，减少了酶分子遭受蛋白水解酶破坏的可能性。
3.3 耐热稳定性试验
肝素修饰尿激酶的热稳定性显著高于未修饰尿激酶。尿激酶的化学修饰是通过将尿激酶与肝素分子中存在的多个活性反应基团形成多点交联，使酶的天然构象产生"钢性"，不易伸展打开，同时减小酶分子内部基团的热振动，从而增强了酶的稳定性。因此，经肝素修饰的尿激酶能适应较广的温度范围，热稳定性更强。
3.4 耐酸碱性试验
尿激酶经肝素修饰后扩大了 pH稳定范围，这是由于修饰酶被“固定”于更活泼状态，当溶液 pH 下降、上升时，酶仍能保持这种活性状态，使其催化功能所受影响较小。
3.5 修饰尿激酶的蛋白电泳检测
经肝素修饰的尿激酶分子量为58KDa，明显高于未修饰尿激酶。且经过葡聚糖凝胶G-100 柱分离纯化，条带单一，可能是由于肝素不适于修饰低分子量的尿激酶，而主要针对高分子量尿激酶进行了有效修饰。低分子量肝素修饰尿激酶迄今国内外少见报道，该修饰酶具有高活性、稳定性强、无毒、无免疫原性等优点，在体内半衰期明显延长，可大大提高其临床疗效；并可应用于该酶的体外实验，对其临床应用进行深入研究。此外，我国自古有喝人尿预防和治疗血栓等疾病的应用，肝素修饰的尿激酶具有较强的抗蛋白酶水解能力，对热及 pH 亦具有较强的稳定性。因此，可将此修饰酶开发为口服制剂预防心脑血管等疾病，使其具备更广阔的应用前景。

来源：惠合胶体磨研磨设备厂

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