韭菜汁分离成分的抑菌作用研究

摘要：用 D- 101 大孔树脂吸附层析法对韭菜汁进行初步分离，对韭菜原汁及其分离成分进行平板法体外抑菌实验。结果表明：韭菜汁对大肠杆菌、绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌、痢疾杆菌等 4 种供试菌都有抑制作用；大孔树脂分段分离成分中，蒸馏水洗脱成分对供试菌无抑菌能力，体积分数 50%乙醇洗脱前段对 4 种供试菌有较强的抑菌作用，体积分数 95%乙醇洗脱段对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌有抑制作用。
韭菜（Chinese chives），在植物学上属百合科葱属，为一种多收的多年生宿根性辛香类蔬菜，大名起阳草、壮阳草、长生韭等。韭菜中含有蛋白质、脂肪、碳水化合物，还有丰富的胡萝卜素、Vc 等维生素。韭菜汁对大肠杆菌、绿脓杆菌等几种常见致病菌有抑菌活性。因此，研究韭菜所含成分的抑菌能力有实际意义。大孔树脂吸附技术已广泛用于中药有效成分的提取、分离、纯化工艺，且越来越多的用于中成药制备工艺，且具有稳定性高、比表面积大、吸附容量大、选择性好和再生处理方便等优点。本文用大孔树脂为固定相，水和不同体积分数的乙醇为流动相对韭菜汁进行梯度洗脱，比较各洗脱部位成分对大肠杆菌、绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌、痢疾杆菌等 4 种菌的抑菌能力，为韭菜提取物的药用价值研究提供理论依据。

1 材料和方法
1.1实验材料
大肠杆菌（Escherichia col）i、绿脓杆菌（P.aeruginosa）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）、痢疾杆菌（Diarrhea bacillus），由遵义医学院珠海校区微生物教研室提供；新鲜韭菜（购于广东珠海金海岸市场）；D- 101 型大孔树脂，天津市大钧科技开发有限公司；体积分数95%乙醇（分析纯）。
1.2 主要仪器设备
立式压力蒸汽灭菌器，江阴滨江医疗设备厂；BHC- 1300IIA/B3生物安全柜，苏州安泰空气技术有限公司；旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂；Scientz- 10N冷冻干燥机，宁波新芝生物科技股份有限公司；UV- 2550 紫外分光光度系统，日本岛津；低温冰箱，海尔；JC303 型电热恒温培养箱，上海成顺仪器仪表有限公司。
1.3 样品制备
1.3.1 韭菜汁的榨取
取新鲜韭菜 500 g，用蒸馏水冲洗干净后，切成小段放入研钵中进行研磨，待韭菜磨成糊状后用干净纱布过滤，对滤液进行抽滤，得 50 mL 滤液放入 4 ℃冰箱中静置 12 h，取上层韭菜汁（相当于新鲜韭菜 10 g/ mL），备用。
1.3.2 大孔树脂的预处理方法
用体积分数 95％乙醇湿法装柱，继续用体积分数 95％乙醇冲洗树脂层，至流出液加水稀释不浑浊。然后用蒸馏水反复洗柱，直到柱子里的大孔树脂被洗成白色，即可投入使用。
1.3.3样品分离
取 1.3.1 制备的韭菜汁 10 mL，树脂柱上样后静置 30 min，用 45 mL 蒸馏水进行洗脱，弃去前10 mL洗脱掖，然后按顺序收集洗脱液三段（每段10 mL），分别标记为样品①、②、③号。然后用45 mL 体积分数 50%的乙醇进行洗脱，弃去前 10mL洗脱液，再按每段 10 mL 收集洗脱液三管，分别标记为样品④、⑤、⑥号。再用 45 mL 体积分数95%的乙醇对柱子进行洗脱，弃去前 10 mL 洗脱液，再按每段 10 mL 收集洗脱液三管，分别标记为样品⑦、⑧、⑨号。
1.3.4样品处理
对④～⑨号样品分别减压浓缩后，冷冻干燥，分别加入 10 mL蒸馏水溶解（相当于新鲜韭菜10 g / mL），4 ℃冰箱中备用。使用前将①～⑨韭菜汁样品用微孔滤膜过滤除菌。
1.4抑菌实验
1.4.1 菌液的制备
从斜面上接种供试菌于肉汤培养基中，37 ℃培养 18 h，将制备的菌液稀释至（106~107）个菌 / mL。
1.4.2 制含菌平板及加样
按文献［6］、［7］的方法制备含菌平板：用融化的琼脂培养基10 mL 倒于平皿中制成平板，用微量加样枪取一种供试菌80 μL，用灭菌涂棒迅速将菌液涂抹匀制成含菌平板，每种供试菌制备 9 个含菌平板。将每个含菌平板分为 4 四个区，在各区中央打一小孔（d =0.70 cm），然后用移液枪吸取各样品 100 μL于不同小孔中，用蒸馏水作为阴性对照。每个样品对每个菌种做 3 个平行板，于 37 ℃培养箱中培养 24 h，观察抑菌大小，记录结果。
1.5 紫外扫描
用 UV- 2550 紫外分光光度计分别对抗菌实验样品①～⑨号，在 200 nm ~ 400 nm 范围内进行步长为 1 nm 的紫外扫描，鉴定样品成分的紫外光谱特征。

2 结果与分析
2.1 抑菌实验结果
韭菜汁对大肠杆菌、绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌、痢疾杆菌都有抑制作用。韭菜汁的大孔树脂分离成分中，蒸馏水洗脱段（①～③号样品）对 4 种供试菌都无抑菌能力。体积分数 50%的乙醇洗脱前两段成分（④、⑤号样品）对 4 种供试菌都有抑菌能力，④号样品对 4 种供试菌的抑菌能力明显比⑤号样品强；而⑥号样品对 4 种供试菌无抑菌能力。体积分数 95%的乙醇洗脱段（⑦～⑨样品），对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌有抑菌能力，抑菌能力顺序为⑦号＞⑧号＞⑨号，显示有效抑菌成分随流出时间的推移浓度在降低，且这些成分对绿脓杆菌、痢疾杆菌供试菌都无抑菌能力。
2.2紫外扫描结果
韭菜汁的蒸馏水洗脱部分①、②、③号样品的紫外光谱吸收曲线形状、峰位相似，说明韭菜汁的蒸馏水洗脱部分前、中、后段成分相同。体积分数50%乙醇洗脱部分④、⑤、⑥号样品及体积分数95%的乙醇洗脱段⑦样品的紫外吸收光谱峰形与蒸馏水洗脱部分的样品图谱形状明显不同，且每个样品的光谱图各有不同特征，说明体积分数50%乙醇不同洗脱段及体积分数 95%的乙醇洗脱段⑦样品的主要分离成分不同。体积分数 95%的乙醇洗脱段的⑧、⑨号样品的紫外吸收光谱，峰形状基本相同，但与①～⑦号样品的紫外吸收光谱都不同，⑧号样品光谱的峰高明显大于⑨号样品，说明⑧号、⑨号两个样品所含物质成分没有紫外吸收差别，峰高不同说明体积分数 95%乙醇的这两个洗脱段所收集的主要成分浓度不相同。

来源：惠合胶体磨研磨设备厂

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